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figure 4-11a. LA BIOLOGÍA DEL CÁNCER. Unidad 3 Oncogenes celulares.

figure 4-01a part 1 of 2. figure 4-01a part 2 of 2.

La técnica de transfección de ADN es utilizada para detectar oncogenes no virales en células transformadas por carcinógenos químicos..

Præ. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 76, NO. II, pp. 5714—5718, Novemt*r 1979 Cell Biology Passage of phenotypes of chemically transformed cells via transfection of DNA and chromatin carcinogenesis/transfcrmation alleles/%uthern blotting) CHIAHO SHIH, BEN-ZION SHILO, MITCHELL P. GOLDFARB, ANN DANNENBERG, AND ROBERT A. WEINBERG Chnter for Cancer Reearch and Of Biol«v, Mavchuætts Institute Of Cambridge, Masachuætts.

ADN extraído de líneas celulares de carcinoma de vesícula, pulmón, colon y leucemia promielocítica humanos..

Utilizando la técnica del Southern blot se pudo comprobar que los oncogenes descubiertos en líneas celulares humanas están estrechamente relacionados con aquellos que son transmitidos por los retrovirus.

figure 4-04. Utilizando la técnica del Southern blot se pudo comprobar que los oncogenes descubiertos en líneas celulares humanas están estrechamente relacionados con aquellos que son transmitidos por los retrovirus.

Southern blott del ADN de células NIH 3T3 transfectadas y transformadas con el ADN extraído de líneas celulares de carcinoma de vejiga urinaria humana. Se utilizó una sonda del oncogén H- ras presente en el genoma del retrovirus del sarcoma de Harvey en rata..

El genoma de los vertebrados contiene un gran grupo de proto-oncogenes..

Ejemplos de oncogenes asociados a retrovirus que han sido también descubiertos en forma alterada en canceres humanos sin la presencia del virus..

figure 4-08. Cual era la transformación molecular que convertía el proto-oncogen c-ras en el oncogén H- ras?.

Clonado de un gen usando vectores plasmídicos. Todos los videos están disponibles en Moodle.

figure 4-09. Localización del segmento del oncogen c- ras responsable de la transformación.

figure 4-10. El oncogén H- ras del carcinoma humano de vejiga y su proto-oncogen c- ras se diferencian en un único nucleótido (mutación puntual).

table 4-02. Lista de células tumorales humanas en la que se detectó mutaciones puntuales en ras.

Todos los videos están disponibles en la plataforma Moodle.

Los proto-oncogenes pueden ser activados a oncogenes por cambios genéticos que afectan tanto la expresión (cantidad) como la estructura de la proteína por ellos codificada (oncoproteína)..

En esta técnica se utiliza una sonda fluorescente que hibrida con el gen en el mismo cromosoma (in situ). Se observan dos núcleos de células de carcinoma mamario en el que el número de copias del oncogén erbB2 (manchas celestes - verdes) indica que se encuentra amplificado. Las manchas rosa-naranjas corresponden a otra sonda que reconoce al oncogén ciclina D1 y muestran que el mismo también esta amplificado. Que número de manchas (copias del gen) esperaríamos encontrar en un núcleo de una célula mamaria normal?.

figure 4-06b. Gráfico de Kaplan-Meier. Aquellos pacientes cuyos tumores tenían un mayor número de copias del oncogén erbB2 fueron más proclives a sufrir reincidencia de la enfermedad.

Micrarreglos de ADN (DNA microarrays ) aplicado al estudio del cáncer.

Figure 4.7 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007).

figure 4-11a. Mecanismo 1. Amplificación de N- myc en un neuroblastoma pediátrico detectada por FISH y observada como regiones de coloración homogénea ( H omogeneous S taining R egion , HSR )..

figure 4-11b. Gráfico de Kaplan Meier mostrando que aquellos pacientes cuyos neuroblastomas tienen más de 10 copias del oncogén N- myc tienen una mucho menor sobrevida libre de eventos de enfermedad (EFS).

table 4-03. Regiones cromosómicas frecuentemente amplificadas en tumores humanos y oncogenes presentes en dichas regiones.

Mecanismo 2. El genoma de los vertebrados contiene un gran grupo de proto-oncogenes..

figure 3-23b. Mecanismo 3. La mutagénesis por inserción es otro de los mecanismos que puede activar al oncogén c- myc.

figure 4-13a. Mecanismo 4. En el linfoma de Burkitt una translocación cromosómica coloca al oncogén c-myc bajo el control del promotor de un gen de una inmunoglobulina.

figure 4-13b. 4. En el linfoma de Burkitt una translocación cromosómica coloca la oncogén c-myc bajo el control del promotor de un gen de una inmunoglobulina.

Translocaciones detectadas en tumores humanos que incrementan la expresión de proto-oncogenes activándolos para dar oncogenes.

figure 4-15a. Otro caso: una translocación crea un gen híbrido entre los proto-oncogenes abl y bcr en más del 90 % de las leucemias mielógenas crónicas.

table 4-05. Translocaciones detectadas en tumores humanos que causan la formación proteínas de fusión oncogénicas con nueva estructura y función.

figure 01 22. figure 04 14b. Las translocaciones cromosómicas también pueden alterar el mecanismo de miARN que regula la velocidad de la traduccion o la degradación de ARNm de ciertos oncogenes.

figure 4-14. Otro ejemplo de activaciones de proto-oncogenes que conducen a cambios estructurales en las proteínas que codifican..

Virus implicados en el origen de cánceres humanos.

ONCOGENES NO HUMANOS. ONCOPROTEÍNA NO HUMANAS. myc o c-myc.

Unidad 3: conceptos claves La dificultad para encontrar virus tumorales en la mayoría los cánceres humanos hizo que el concepto de que los carcinógenos actuaban como mutágenos, y que como tales mutaban genes normales a oncogenes , quedara como la principal teoría del origen del cáncer. Este modelo predecía que las células transformadas tenían genes mutados funcionado como oncogenes. Para verificar esta predicción se diseñó una estrategia experimental que consistía en introducir ADN de células químicamente transformadas dentro de células normales ( transfección ) y observar si estas células recipientes eran, a su vez, transformadas por estos oncogenes. Células NIH 3T3 cultivadas y transfectadas con ADN proveniente de células de ratón que habían sido químicamente transformadas produjeron focos de células anclaje independientes y con capacidad tumorigénicas en animales hospedadores. Esto demostró que las células químicamente transformadas tenían genes que podían transformarse en oncogenes en forma independiente de las infecciones virales. Experimentos similares utilizando ADN proveniente de líneas celulares tumorales humanas para transfectar células murinas demostró que los oncogenes podían actuar en tejidos y especies diferentes de aquellos en los que se habían originado. Se detectó que los oncogenes encontrados en células tumorales humanas, utilizando estos experimentos de transfección, y los oncogenes de los virus tumorales, provenían de los mismos proto-oncogenes celulares normales preexistentes. Así, muchos oncogenes originalmente descubiertos en retrovirus fueron redescubiertos en los genomas de células tumorales humanas. Se descubrió que varios oncogenes se encontraban repetidos en numerosas copias ( amplificados ) en las células tumorales humanas lo que sugería que su producto proteico se encontraba en cantidades mayores que las normales, lo que de alguna manera impulsaba la proliferación celular. Un ejemplo fue la amplificación del gen erb 2 / neu / HER2 y la expresión incrementada de la proteína que codifica, ahora una oncoproteína, en el cáncer de mama. Además, se pudo observar que la amplificación correlacionaba negativametne con la sobrevida de los pacientes..

Mientras la activación de los genes asociados a retrovirus se debía a que su expresión quedaba bajo el control de los potentes promotores retrovirales, no estaba claro cuales eran los mecanismos de activación por los cuales los proto-oncogenes humanos normales se convertían en oncogenes. La secuenciación del oncogen H- ras reveló que difería de su versión proto-oncogénica normal en un único nucleótido, producto de una mutación puntual , que resultaba en la sustitución de un aminoácido en su producto proteico, lo que a su vez conducía al comportamiento aberrante de este último. En algunos casos se detectó que ambos mecanismos, el regulatorio, que llevaba a una sobre- expresión de la oncoproteína, y el estructural, que producía un cambio en la conformación de la proteína, colaboraban simultáneamente en la activación del oncogen. Se descubrió que el oncogen myc puede surgir por cuatro mecanismos distintos: integración vírica, mutagénesis por inserción, amplificación génica y translocación cromosómica. La amplificación génica resulta en genes alineados uno detrás del otro, lo que se manifiesta en regiones de coloración homogénea ( HSR ) en los cromosomas, utilizando la técnica de hibridación fluorescente in vitro ( FISH ). La translocación involucra la fusión de una región de un cromosoma a otro cromosoma no homólogo. La misma puede colocar a un gen bajo el control de un promotor transcripcional extraño que produzca su sobreexpresión. Esto es lo que sucede con el oncogen myc en el linfoma de Burkitt, en el que luego de una translocacion, el gen queda bajo el control de promotor muy activo del gen de una inmunoglobulina. La translocación también puede remover de una molécula de ARNm la secuencia 3´UTR reconocida por un microARN eliminando el efecto inhibitorio de este último. Una variedad de cambios estructurales en proteínas importantes puede también ser producido por la activación de otros oncogenes. Dos ejemplos son la alteración en la estructura del receptor del factor de crecimiento epidérmico ( EGF ) y la translocación que conduce a la fusión de dos genes distintos dando una proteína híbrida, como es el caso de la fusión entre Bcr y Abl en varios tumores y leucemias..