PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

abstract. PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS. Es una serie de procesos que permite aislar la proteína de estudio de una mezcla compleja, es decir, poder retener la mayor cantidad de proteína de estudio funcional con el menor número de contaminantes de una mezcla compleja..

QUÉ DEBEMOS TENER EN CUENTA ?. Para qué quiero purificar la proteína? Conocimiento de actividad, concentración o purificación. Qué propiedades tiene la proteína de estudio ? Masa Molecular, Punto Isoeléctrico, Solubilidad, Estabilidad De donde vamos a obtener la proteína? Localización subcelular, tejido, organismo . Cuidados de la muestra al momento de la purificación. Qué técnicas vamos a utilizar para purificar..

PARA QUÉ QUIERO PURIFICAR LA PROTEÍNA. La purificación es un proceso que se puede utilizar para estudiar diferentes afinidades: Su función biológica, evaluar la estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas, hacer análisis filogenéticos, analizar la relación estructura-función. E stá información se puede utilizar para aplicarlo en la medicina, en acciones terapéuticas, suplementos alimenticios, detergentes, limpiadores o cosméticos, etc..

QUÉ PROPIEDADES TIENE LA PROTEÍNA DE ESTUDIO. Masa Molecular Conocer el tamaño de la proteína es importante cuando hacemos un gel SDS-PAGE o métodos cromatográficos para purificar la proteína como filtración en gel.

DE DÓNDE OBTENEMOS LAS PROTEÍNAS ?. Las fuentes de proteínas adecuadas para la recogida de muestras pueden incluir fuentes nativas derivadas de cultivos de células, tejidos o fluidos corporales de mamíferos. Alternativamente, las proteínas pueden aislarse de sistemas tales como levaduras, bacterias, insectos..

CONDICIONES DE TRABAJO. Para poder obtener de manera efectiva las proteínas de la célula debemos respetar ciertas condiciones de trabajo para no provocar la desnaturalización de la misma. Temperatura de trabajo ( temperatura bajas) Ph de la solución Fuerza ionica Disolventes organicos.

E s importante tener estabilizado el extracto proteico, ya que existen ciertos factores que pueden dañarlo de forma irreversible: pH : Los componentes biológicos se disuelven en soluciones reguladoras eficaces en el rango de pH en cual los materiales son estables, si no se hace de esta forma puede causar una desnaturalización. Temperatura: la estabilidad térmica de las proteínas varía , en necesario realizarlo a temperaturas bajas, cercanas a cero. Presencia de enzimas de degradación: cuando los tejidos se destruyen para liberar la proteína de interés, se liberan enzimas de degradación, las cuales pueden inhibirse si se ajustan el pH y T (proteasas, nucleasas) Adsorción a superficies: muchas proteínas se desnaturalizan por contacto con la interfaz aire/agua o con la superficies vidrio o plástico..

MÉTODOS GENE RA L ES. Ruptura del material Obtención del material libre de células Precipitación Concentración de proteínas Fraccionamiento.

La homogeneización consiste en disgregar los tejidos en las células que los componen y luego realizar la lisis de las células, de tal modo que se liberen sus componentes, en particular sus organelos, sin que estos sufran mayores daños. El uso de instrumentos como morteros, jeringas, homogeneizadores permiten la disgregación y lisis celular. El lisis celular también podría darse por el uso de soluciones hipotónicas ; La diferencia en la presión osmótica entre la solución y la célula causan el lisamiento de la célula ..

Tipos de homogeneizadores:. ‹#›. Tabla 1. Métodos fisicos para la dirupciön de muestras Método Licuadora Homogenizador Dounce Homogenizador de ultrasonidos Pulverizacién en Nitrogeno liquido Perlas de vidrio Descripciön La muestra se tritura mediante cuchillas rotatorias Tubo de vidio con piston ajustado maja las células por ac- ciön de corte. Ondas de sonido emitidas por una sonda para romper las membranas celu- lares La muestra se pulve- riza utilizando un mortero y una almi- rez refrigerados La ruptura celular se produce por agita- ciön de las perias de vidrio Tipo de muestra Gran cantidad de tejido Células tisulares; Util para protocolos de enriquecimiento de proteinas mitocon- diales o nucleares Células, tejidos, bac- tefas. Tejdo animal o o vegetal Levaduras.

Algunos tipos de homogeneizadores:. Mortero: El uso del mortero es más convencional , siendo una herramienta fácil de utilizar. Aunque no es el más efectivo de los métodos ..

Obtención del material libre de células. Esta mezcla que contiene enzimas, membranas y células rotas se somete a centrifugación para eliminar los restos celulares y separar el sobrenadante el cual contiene las proteínas solubles..

CENTRIFUGACIÓN. Centrifugación diferencial es un proceso de separación que puede separar los componentes celulares por centrifugación repetida, a velocidades cada vez mayores. En estas condiciones, los componentes de la célula se separan en función de su tamaño y densidad: los componentes de gran tamaño y más densos migran más rápidamente hasta el fondo a velocidades relativamente bajas y forman un sedimento..

PRECIPITACIÓN. ‹#›. Se busca reducir la solubilidad de la proteína del medio acuoso. Minimizar las interacciones H2O-proteína y aumentar las interacciones proteína-proteína modificando factores como el pH, temperatura y fuerza iónica. El agregado de sulfato de amonio ((NH4)2SO4) es uno de los métodos más conocidos. Cuando los iones de amonio (NH4+) y sulfato (SO42−) están dentro de la solución acuosa se sienten atraídos por las cargas opuestas en el compuesto que se está purificando. Esta atracción de cargas opuestas evita que las moléculas de agua interactúen con el compuesto que se está purificando, lo que lleva a la precipitación..

DIALISIS. ‹#›. Es un procedimiento que separa las proteínas de las disolventes aprovechando el mayor tamaño de las proteínas. Este proceso retiene las proteínas grandes dentro del saco de membrana semipermeable, mientras que permite que la concentración de las demás solutos en la preparación de proteína cambia hasta llegar al equilibrio con la solución del exterior. Puede utilizarse para eliminar el (NH 4 ) 2 SO 4.

GRACIAS. ‹#›. abstract.